Hoe werkt een EM?

Beeldvorming in een TEM en SEM

Filmpje van hooikoorts.tv over de laser en de elektronenmicroscoop van het GI in Nijmegen

Elektronenmicroscopen (EM) worden gebruikt om structuren te kunnen bestuderen die te klein zijn om door het naakte oog goed gezien te worden of om door een lichtmicroscoop te worden waargenomen. De twee belangrijkste typen EM technieken zijn Transmissie Elektronenmicroscopen (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopen (SEM).
 
In de inleiding over elektronemicroscopie hebben we gezien dat TEM en SEM verschillende soorten beelden produceren, grof gezegd, respectievelijk beelden van doorsneden (TEM) of beelden van de oppervlakte van objecten (SEM). Hoewel beide technieken gebruik maken van elektronen om een vergroot beeld te verkrijgen, functioneren ze volgens verschillende principes.
De mechanismen waarop TEM en SEM berusten worden hieronder in het kort toegelicht:
 

Principe van Transmissie & Scanning Elektronen Microscopie
Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM)	Scanning Elektronenmicroscoop (SEM)
Hoe ontstaat een vergroot beeld in een TEM? Bij een TEM wordt het object (bijvoorbeeld een klompje cellen) doorgaans vooraf in uiterst dunne plakjes (coupes <100nm) gesneden en voorbehandeld met zware metalen die zich bij voorkeur hechten ("kleuren") aan bepaalde kenmerkende structuren zoals membranen, eiwitten en DNA (zie voorbereiding TEM). Soms zijn objecten dun genoeg om elektronen uit de bron gedeeltelijk door te laten (bijv. sommige chemische aggregaten of virussen) en is voorbehandeling nauwelijks nodig. Eenmaal in de TEM wordt het object door een bundel elektronen, de zogenaamde primaire elektronen, "gebombardeerd". Op plaatsen in het object waar deze elektronen atomen tegenkomen met een grote (zware) atoomkern (zoals met name de kernen van de zware metalen van de voorbehandeling), ketsen ze terug. Elektronen worden eveneens geweerd op plekken waar het materiaal van het object relatief dicht of dik is. Maar daar waar het materiaal uit lichtere atomen bestaat of waar het dunner is of minder geconcentreerd is, kunnen de elektronen wel doorgang vinden. Uiteindelijk bereiken de doorgelaten elektronen (transmissie = doorgelaten) de scintilatorplaat onderaan in de kolom van de microscoop (bekijk foto's van het beeld op de scintillator en de TEM in werking). De scintillator bevat materiaal (bijv. fosforverbindingen) dat in staat om de energie van de elektronen op te nemen en vervolgens om te zetten in lichtpaketten. Het contrastrijk beeld dat op deze plaat ontstaat komt overeen met het selectief patroon van terugkaatsen of juist doorgaan van elektronen, afhankelijk van de plaatselijke eigenschappen van het object. Je kunt dus bijvoorbeeld zien waar cytoskelet elementen en membranen zich bevinden omdat de overeenkomstige plekken donker blijven, terwijl het cytosol eromheen als licht verschijnt (zie voorbeeld; G= Golgi, AF = Actine filamenten, Mt = Mitochondrion). In de praktijk worden de bombarderende elektronen als een bundel op het object gefocust en wordt het fijnmazig patroon elektronen dat uit het object uittreedt met behulp van elektromagnetische lenzen wijd uit elkaar getrokken: er ontstaat een vele malen vergroot projectiebeeld.	Bij SEM wordt het object volgens een scanning beweging gebombardeerd door de primaire elektronen afkomstig van de bron. Deze invallende elektronen maken aan de oppervlakte van het object secundaire elektronen vrij (tot op zekere hoogte is het effect te vergelijken met die van biljartballen, waarbij de ene bal de andere wegstoot). De hoogte en helling van de oppervlakte van het object op een bepaalde plek zijn (mede)bepalend voor het aantal gegenereerde secundaire elektronen per tijdseenheid en voor de snelheid van deze elektronen. Deze losgeslagen (secundaire) elektronen worden vervolgens aangetrokken door de Corona ring en naar een scintillatieplaat geleid. Zoals bij de TEM bevat deze plaat materiaal dat de energie van de inkomende elektronen in licht kan omzetten. Des te meer secundaire elektronen de scintillator bereiken, des te helderder het oplichten is. De lichtsignalen worden vervolgens door een photomultiplier versterkt omgezet naar een video signaal. Dat signaal wordt in synchronie met de scanbeweging van de electronenbundel via een kathode straalbuis op een scherm tot een zichtbaar beeld geprojecteerd. Tegenwoordig wordt dit signaal meestal nog gedigitaliseerd. Er wordt dan een monochroom (grijstinten) computer-beeld gegenereerd dat verder digitaal bewerkt kan worden. De intensiteitenpatroon in het eindbeeld laten een soort drie-dimensionele schaduwweergave van het oppervlakte van het monster zien (voorbeeld van een Ambrosia pollenkorrel).   In Cryo-SEM microscopen kan bevroren materiaal, bijv. cellen, worden gebroken om een beeld te verkrijgen van de oppervlakte van de structuren binnen het afgebroken volume. In microscopen voorzien van EDS (Energy Dispersed Spectroscopy) of EDAX (Energy-Dispersed Analysis of X-rays) detectoren waarmee de energie van rechtstreeks weerkaatse elektronen (back scattering) en Röntgenstraling opgenomen kan worden, is het mogelijk om op te sporen welke elementen aanwezig zijn in de oppervlaktelaag van het monster.
Transmissie Elektronen Microscoop (TEM) 1: Elektronen kanon aan de bovenkant van de kolom. 2 Elektro-magnetische lenzen om de elektronenbundel te richten en te focussen binnen de kolom. 3: Vacuum pompen systeem. 4: Kamertje waarin gridjes met monsters worden ingesluisd ter observatie in het hoog-vacuum gedeelte aan de binnenkant van de kolom. 5: Bedieningspanelen (links voor uitlijning; rechts voor vergroting en scherpstelling; pijlen voor de positionering van het object binnen de kolom). 6: Scherm voor menu- en beeldweergave. 7: Watertoevoer tbv de koeling van het instrument.	Scanning Elektronen Microscoop (SEM) 1: Elektronen kanon aan de bovenkant van de kolom (hier een zogenaamde Field-emissie bron). 2 Elektro-magnetische lenzen om de elektronenbundel te richten en te focussen binnen de kolom. 3: Vacuum pompen systeem. 4: Doorgang om het object bij conventionele SEM naar het hoog-vacuum opname gedeelte in te sluizen. 5: Bedieningspaneel. 6: Scherm voor menu- en beeldweergave. 7: Cryoeenheid voor het breken, coaten en sublimeren van ingevroren materiaal voor het verder in de observatiekamer wordt ingesluisd. 8: Elekronica opgeborgen in kasten onder het bureaublad. 9: Analiste Mieke Wolters-Arts en technicus Geert-Jan Janssen bij het bespreken van de opname.