Practicum microscoop |
||||||
De microscoop is een krachtig instrument voor het waarnemen voorbij de grenzen van de eigen zintuigen. Niet voor niets is het een symbool geworden voor de natuurwetenschappelijke kijk (Gr. micros = klein, skopein = zien; ook onder de onzijdige vorm het microscoop taalkundig correct). Microscopie is niet alleen in het onderwijs een erg nuttig hulpmiddel om de bouw van organismen en cellen te leren kennen (zie hier een greep uit beelden van onderwijspreparaten), het vindt ook brede toepassingen in het wetenschappelijk onderzoek. Misschien belangrijker nog: microscopie is vooral ontzettend leuk; er gaat letterlijk een wereld voor je open!
Op deze pagina zijn wat informatie en praktische tips samengebracht over de onderdelen en de optimale instelling van een lichtmicroscoop (Nootje: in dit geval het type dat door de Nijmeegse studenten Bio-wetenschappen gebruikt wordt, maar ook andere firma's leveren uitstekende studiemicroscopen). HET PRAKTISCH NUT VAN DE MICROSCOOP Het menselijk oog kan twee naburige punten slechts dan als afzonderlijke punten waarnemen (oplossen), wanneer de gezichtshoek groter is dan één hoekminuut. Dit betekent dat bij een oogafstand van 25 cm, de onderlinge afstand tussen twee punten niet meer dan 0,07 mm (= 70 micrometer, afgekort 70 μm) mag bedragen om die punten als aparte structuren te kunnen onderscheiden. In de praktijk ligt het maximale oplossend vermogen van het ongewapende oog zelden op de theoretische waarde van 0,07 mm, maar eerder tussen 0,1 en 0,2 mm. Om punten die dichter bij elkaar liggen toch gescheiden te kunnen zien, moet het beeld van het object met zo min mogelijk detailverlies over een groter gebied van het netvlies gespreid worden, oftewel onder een grotere hoek op het netvlies geprojecteerd worden. Dat is feitelijk de clou van wat er met vergroten gebeurt en dat is ook precies wat het lenzenstelsel van microscopen doet. Met een gewone (transmissie) lichtmicroscoop kan een oplossend vermogen van ongeveer 0.3 μm bereikt worden. Dat is ongeveer een factor 300 keer nauwkeuriger dan met een ongewapend oog. De objecten zelf kunnen biologische preparaten zijn die een paar millimeters groot zijn.
DE ONDERDELENAlle hiergenoemde onderdelen en een optimale instelling van de microscoop zijn van belang voor een scherpe, contrastrijke en natuurgetrouwe waarneming. De practicummicroscoop bestaat uit een gebogen statief (16) met een voet (15). Hieraan zijn alle andere onderdelen opgehangen. Het statief is stevig uitgevoerd, het moet stabiel staan en zo weinig mogelijk bewegingen en trillingen uit de omgeving doorgeven.
De vijf belangrijke delen van deze studiemicroscoop zijn: 1. De lichtbron De lichtbron bestaat uit een halogeenlampje dat een helder wit licht geeft. De stroomkabel kan aangesloten worden op een normale 220V bron. De intensiteit van het lampje (13) is regelbaar met een oplichtende regelschroef (14). Het licht wordt geconcentreerd door een simpel collectorlensje. Via een spiegel wordt het lamplicht door een opening in het statief in de richting van het object gestuurd. De grootte van het verlichte veld in het preparaat kan met behulp van het velddiafragma (12) geregeld worden zonder dat de helderheid van het beeld verandert. Door de opening van het velddiafragma zo in te stellen dat net het hele gezichtveld gevuld is, wordt voorkomen dat er strooilicht door het preparaat valt. De diafragma-opening is afgesloten met een stofdicht glas waarop eventueel een grijs of kleurfilter gelegd kan worden.
2. Een stel lenzen om het licht te bundelen en op het preparaat te projecterenHet licht dat uit het velddiafragma (12) komt wordt door de condensor (6; een systeem bestaande uit een tweetal lenzen), op het preparaat gebundeld geprojecteerd. Het brandpunt van de condensor moet zo ingesteld zijn dat de rand van het velddiafragma precies in het vlak van het scherp ingesteld preparaat valt, en ook nog in het centrum van dit vlak terwijl de belichting egaal is. Om de hoogte van het brandpunt van de condensor correct in te stellen, gebruikt men verstelschroef 9, om de bundel te centreren twee verstelschoeven 8 voor de twee loodrechte richtingen. (Deze XY-positie is in de practicummicroscopen meestal al goed ingesteld). De condensor is ook uitgerust met een diafragma, het condensor-diafragma (7), dat de lichtbundel begrenst.3. De tafel waarop het object gepositioneerd kan worden Bij het bekijken van een preparaat is het niet alleen erg handig dat het op een vaste plaats gefixeerd kan worden gedurende het waarnemen, maar moet het ook makkelijk verplaatst kunnen worden om het hele preparaat te kunnen onderzoeken. Daarom is er een horizontale plaat aan het statief bevestigd, de objecttafel (4), waarop het preparaat ingeklemd kan worden. In de plaat zit een ronde uitsparing waardoor het licht van de condensor op het preparaat kan vallen. Om het preparaat over deze opening te kunnen verplaatsen, is aan de objecttafel een kruistafel (5) gemonteerd, die voorzien is van twee schuifbare assen, voor X- en Y-richting. Op de kruistafel (5) staan cijfers en een onderverdeling (5; nonius, zoals bij een schuifmaat) waarmee de precieze ligging (coördinaten) van een bepaald punt in een preparaat vastgelegd kan worden (handig om een structuur terug te vinden).
4. Een stel lenzen om het beeld te vergrotenBoven de tafel bevinden zich vier lenzenstellen, objectieven (3) oftewel voorwerplenzen (droge objectieven: 4x, 10x, 40x en een olie-immersie objectief: 100x), die gemonteerd zijn op een draaibare revolver (Lat. revolvere = omdraaien). Met deze revolver kan de lens met de gewenste vergroting boven het preparaat worden gedraaid. Het objectief vormt een vergroot beeld uit het licht dat door het preparaat (of een deel ervan) valt. Via een prisma wordt dit beeld verder in het schuine deel van de tubus (2) geleid en door middel van het oculair (1) (Lat. oculus = oog), ook ooglens genoemd, verder vergroot (tot een virtueel of imaginair beeld). In het oculair zit een ring (vast diafragma) die het uittredende beeld begrenst en strooilicht blokkeert: de uittredepupil. Om de microscoop voor personen met verschillende ogen zo gebruikersvriendelijk te maken, kan men na scherpstelling op het rechteroog, de focus voor het linkeroog bijregelen met de draairing op het linker-oculair. Ook de afstand tussen de twee oculairen is instelbaar.5. Een mechaniek om de lenzen op de juiste afstand tot het object te brengen (10 en 11) De hoogte van de objecttafel kan ingesteld worden door middel van twee schroeven, de macrometerschroef (10) voor grove instelling en de micrometerschroef (11) voor de fijne instelling. Met deze schroeven kan het preparaat precies in het brandpunt van de objectieven, gebracht worden zodat het object scherp wordt afgebeeld.
BELANGRIJKE BEGRIPPEN BIJ MICROSCOPISCHE WAARNEMINGBelangrijke begrippen voor het microscopiseren zijn het oplossend vermogen, lichtsterkte in het eindbeeld, de scherpte, de scherptediepte, het gezichtsveld, de werkafstand, de helderheid, het contrast en kleuren.Oplossend vermogenOplossend vermogen: zie hierboven.Lichsterkte in het eindbeeldDe lichtsterkte in het eindbeeld wordt op de eerste plaats bepaald door de helderheid van de lichtbron (de lichtintensiteit regel je met knop 14 uit figuur 1), de hoogte en gecentreerde instelling van de condensor en de stand van het condensordiafragma (niet dichtknijpen om een donkerder beeld te verkrijgen: gaat ten koste van de beeldkwaliteit). Verder spelen een rol de algemene doorzichtigheid van het preparaat en de eigenschappen van de verschillende lenzen, zoals de relatieve lensopening (D/f = diameter/brandpuntsafstand), de helderheid van het lensmateriaal en het aantal corrigerende lenzen (Noot: elke tussenlaag absorbeert licht).ScherpteDe scherpte is de breedte van het overgangsgebied tussen twee punten/velden met verschillende helderheid. De scherpte is afhankelijk van de golflengte, de vergroting en de kwaliteit van het lenzensysteem, maar natuurlijk ook van het preparaat.ScherptediepteDe scherptediepte is de dikte van de laag waarbij alle onderdelen van die laag nog scherp worden waargenomen. Een vaste grens is niet te geven. De scherptediepte wordt bepaald door de feitelijke numerieke apertuur (bij een dicht condensordiafragma is de scherptediepte groter, maar het oplossend vermogen kleiner), de vergroting, maar ook de eigenschappen van de ogen van de waarnemer. Bij een 100x objectief is de scherptediepte slechts ongeveer 3 x 10-4 mm. Om een indruk te krijgen van een preparaat is het dus noodzakelijk door het object heen te focusseren.GezichtsveldHet gezichtsveld zegt iets over de omvang van het afgebeelde objectveld. Ze wordt bepaald door de relatieve lensopening (D/f waarbij D= diameter van de lens en f = brandpuntsafstand) en de actuele lensdiameter.WerkafstandDe werkafstand is de maximale afstand tussen de de voorlens van het objectief en het preparaat waarbij je nog een scherp beeld kunt krijgen. (Bij objectieven met een kleine werkafstand kan het zich voordoen dat preparaat, insluitmedium en dekglas tesamen een te dikke laag vormen om nog op het object te kunnen focussen).Helderheid en contrastDe helderheid van het beeld betreft de hoeveelheid licht die op een bepaald punt op een preparaat valt. Het contrast is het percentuele verschil in helderheid tussen twee punten. Onze ogen kunnen gemiddeld tot een verschil van 7% in contrast onderscheiden. Om helderheid en contrast te optimaliseren dient de microscoop natuurlijk goed uitgericht te zijn (zie onderdeel 7.1. van het practicum: Koehlerbelichting), maar zeker zo belangrijk is een schoon preparaat, dat vrij is van vlekken en olieresten. Overstraling of juist onderbelichting van het preparaat is ongeriefelijk voor het kijken. Bovendien wordt het contrast dan slechter, waardoor een deel van de informatie verloren gaat. Een aan het preparaat en het objectief aangepaste lichtintensiteit wordt verkregen met behulp van de schroefregeling (14), niet door het condensor-diafragma dicht te knijpen, omdat dan het oplossend vermogen achteruit gaat. Wanneer de lichtsterkte in de minimumstand toch nog te hoog is, kan men een grijsfilter op het glas boven het velddiafragma (12) leggen. Bij extreem contrast-arme preparaten draait men soms het condensordiafragma iets dicht. Dit is vooral zinnig bij lage vergrotingen (tot 25x). Een dichte stand van het condensordiafragma is bij hogere vergroting sterk af te raden, omdat de resolutie veel slechter wordt en omdat er ringvormige schitteringen en brekingen (artefacten) ontstaan aan de rand van kleine structuren. Bij teveel contrast kan men het lichtniveau eventueel wat veranderen of filters gebruiken, maar veel mogelijkheden zijn er verder niet voor oogobservatie (wel kan men nog winst boeken met speciale digitale camera�s en beeldbewerking).KleurenHet gebruik van kleuringen in een preparaat bevordert het vermogen om delen (specifiek) te kunnen onderscheiden. Bij ongekleurde preparaten biedt het gebruik van een groenfilter een aantal voordelen: de grote gevoeligheid van onze ogen voor de kleur groen, kijkcomfort bij de doorgaans als rustig ervaren achtergrondskleur groen, de relatief lage golflengte (550 nm) van deze kleur waardoor een goede resolutie mogelijk is, benadering van monochromatische belichting waardoor chromatische aberratie ("kleurensmeer" die onstaat doordat verschillende kleuren kleine verschillen in brandpuntsafstand vertonen) wordt voorkomen.INSTELLEN VAN DE MICROSCOOPKoehlerbelichting
Objectief keuze: van 10x droog tot 100x immersieolieBij het instellen wordt altijd eerst het kleinste 4x objectief gebruikt (voor cytologisch werk het 10x objectief). Daarna kan, indien gewenst, het volgende objectief voorgedraaid worden. Het scherpstellen geschiedt dan uitsluitend met de micrometerschroef (fijne instelling). Tijdens het waarnemen wordt hiermee op en neer gedraaid om een indruk van de ruimtelijke bouw van het object te krijgen. Bij wisseling van objectief moeten de diafragma's opnieuw ingesteld worden!Voor men overgaat op de 100x olie-immersie lens, wordt het object met het objectief 40x scherp in beeld gezet. (Ga nooit direct van een klein droog objectief naar een 100x immersieolie objectief, de lens kan het preparaat raken en zo krassen oplopen). Het gewenste deel van het preparaat moet zich in het midden van het gezichtsveld bevinden. De revolver wordt weggedraaid en een druppeltje olie wordt op het schone dekglas aangebracht zonder uitvloeiend medium aan de randen. Dan wordt de 100x immersielens voorgedraaid. Controleer of de lens de olie raakt. Daarna wordt met de micrometerschroef op het object scherpgesteld. Als hetzelfde preparaat m.b.v. andere objectieven nog verder bekeken wordt, moet het dekglas tevoren worden schoongemaakt met alkohol. Onbetwist voordeel van het werken met een 100x olieimmersie objectief is de goede resolutie. Nadelig zijn echter het beperkt gezichtsveld, de kleine werkafstand en lage scherptediepte, waardoor het risico om bij het focussen door het preparaat heen te draaien en onherstelbare schade aan te richten vergroot worden. Opletten dus! Schoonhouden van de microscoopDraai voor het verwijderen van het preparaat steeds de tubus omhoog. Reinig na afloop van elk practicum de microscoop en de preparaten zorgvuldig. Stof op de oculairen (draait met de oculairen mee in het beeld) verwijderen met een zachte linnen of katoenen doek (een oude vaak gewassen zakdoek is het beste hulpmiddel voor de microscoop!). Het oculair in de tubus laten zitten. Voor het opbergen steeds kontroleren of er zich nog olie op het olieimmersie-objektief bevindt; deze zorgvuldig verwijderen met een zachte droge katoenen doek of watten. Gebruik nooit organische oplosmiddelen, deze lossen de kit op waarmee de lens in het objectief bevestigd is! Na afloop, altijd de tubus omhoog draaien tot de objectieven geheel vrij staan van de tafel. Gebruik geen lenspapier om schoon te maken! Het dient alleen als stof-vrij vloeipapier! Preparaat verwijderen en schoonmaken.Houd de lenzen en de tafel schoon (spoel bijv. buffervlekken meteen met water af omdat de zouten erin corrosie veroorzaken) en forceer het mechaniek niet als het stroef zou lopen. Berg de microscoop op met de hoes erom.Links
|
||||||
