Lichtmicroscopie technieken

"Een microscopist denkt met de ogen en kijkt met het brein." (Prof. Daniel Mazia, 1996)

 
Bij het samenstellen van het beeldmateriaal voor de Virtual Classroom biologie is intensief gebruik gemaakt van microscopie-, (micro)fotografie- en beeldbewerkingstechnieken die bij de Beta faculteit van de Radboud Universiteit Nijmegen in onderzoek en onderwijs worden toegepast. In het kader van "een kijkje nemen over de schouder van biologiestudenten" zijn hier een aantal van de toegepaste lichtmicroscopie-technieken toegelicht (met plaatjes!), met name conventionele transmissie lichtmicroscopie, video microscopie, fluorescentie imaging en confocale laser microscopie met een 3D-viewer. Over de elektronenmicroscopie (EM) waarmee micrometer en nanometer-kleine structuren zichtbaar gemaakt kunnen worden zijn twee aparte webmodules samengesteld: eentje over de technische aspecten van EM en eentje over EM toepassingen, met o.a. een EM simulator. Scanning Probe Microscopen waarmee atomen en moleculen op oppervlakken zichtbaar gemaakt kunnen worden bij het SPM-Lab van natuurkunde uitgebreid besproken.
 

 
Lichtmicroscopen worden ingezet om objecten te bestuderen in de ordegrootte van 1 µm (een duizendste millimeter) tot 5 mm. De meeste plaatjes worden met helderveld opgenomen (1A). Onder practicum microscoop kun je zien welke microscoop de studenten gebruiken ompreparaten te bekijken en hoe deze (maar ook andere) microscopen het beste ingesteld kunnen worden. Specifieke kleurstoffen (bijv. Alcian blauw, hematoxiline, toluidine blauw en eosine) worden vaak gebruikt om structuren in het biologisch materiaal voor de microscopische preparaten selectief te benadrukken. Andere technieken om bepaalde structuren uit te lichten zijn fase contrast (1B), donkerveld (1C), Normarski/differentieel interferentie contrast (=DIC, 1D), gewone fluorescentie microscopie (1E, 1F, 1G) en confocale laser scanning microscopie (1H en 1I).
 

Verschillende lichtmicroscopische technieken
A-D transmissie en E-G fluorescentie microscopie. Bijdragen: J.W.M. Derksen, B. Kramer, M.C. Nardi, E.S. Pierson, H.P. Xu en G. Bögemann.
1A. Helderveld opname van delende cellen in de top van een worteltje van een ui gekleurd met hematoxyline. 1B. Fasecontrast opname van delende cellen in de top van een worteltje van een ui gekleurd met hematoxyline. 1C. Donkerveldopname van stuifmeel moedercellen van Lilium candidum. Door de breking van lichtstralen lichten de celwanden op. 1D. Differentieel interferentie contrast van gekiemd stuifmeel van tabak (Nicotiana tabacum). De blauwe kleur die ontstaan is als gevolge van een zogeheten GUS-reactie toont aan dat een bepaald gen actief is geweest in deze cel. 1E. Fluorescentie opname van hersencellen van een Zuid-Afrikaanse klauwpad (Xenopus laevis). De cellen zijn gekleurd met DiI, een stof die aan vetachtige substanties hecht. 1F. Fluorescentieopnamen van geïsoleerde spermacellen van tabak (Nicotiana tabacum) die behandeld zijn met fluoresceine diacetaat. De groene fluorescentie-kleur geeft aan dat deze cellen levend zijn. 1G. Fluorescentieopnamen van geïsoleerde spermacellen van tabak (Nicotiana tabacum). De blauw fluorescerende stof DAPI kleurt specifiek het DNA in de celkern. 1H en I. Confocal laser scanning microscopie (projectie) opname die het GFP patroon en de autofluorescentie toont in een genetisch gemodificeerde kiemplant (pluimpje en worteltje).

 
Modern onderzoek vergt het gebruik van specifieke (tegenwoordig vaak fluorescerende) merkstoffen, zoals in labelingen met antilichamen, enzymatische reacties, Green Fluorescent Proteins, organel-specifieke kleurstoffen en ionen-indicatoren. Daarbij wordt vaak een combinatie van verschillende fluorescerende stoffen aan de preparaten toegevoegd (bijv. een fluorochroom met groene emissie om mitochondria aan te tonen samen met een blauw-fluorescerende stofom het DNA van de kern te kleuren). Ook is het mogelijk geworden om kwantitatief te meten hoe intens het fluorescentiesignaal is als maat voor de aanwezigheid van een bepaald element of bestanddeel. Ook bestaan er zogenaamde ratio fluorescentie stoffen waarmee men door vergelijking van de intensiteit van het signaal bij twee (excitatie of emissie) kleuren de concentratie van de gebonden stof kan bepalen.