TEM monsters

TEM leent zich vooral om de binnenkant van plakjes (coupes <100 nm) van heel kleine objecten te bestuderen, bijv. membranen, kernen en organellen van cellen. Maar ook extreem dunne objecten zoals virussen of macromoleculaire aggregaten (bijv. ringen van porfyrine polymeren) kunnen als geheel met dit instrument onderzocht worden. In "Hoe werkt een EM? hebben we gezien dat de zwarting in het eindbeeld wordt bepaald door de elektronen ondoorlaatbaarheid van het object. Hieronder wordt uitgelegd hoe de preparaten voor TEM klaargemaakt kunnen worden.
 

Voorbeeld van TEM beelden
Organellen in een stuifmeelbuis van tabak (Nicotiana tabacum; AF = Actine filamenten; G = Golgi apparaat; Mi = Mitochondrion; Mt = Microtubulus; zoom). Opnamen: A.M. Wolters-Arts, Radboud Universiteit Nijmegen).	Hexagonaal patroon van gezuiverde Cowpea Chlorotic Mottle Virussen (CCMV) die negatief gekleurd zijn met uranylacetaat (zuivering bij hoge zout concentratie; zoom) Werk van Marta Comellas (Afdeling Organische Scheikunde)	Verspreid patroon van CCMV, deze keer gezuiverd bij een lagere zoutconcentratie (zoom) Werk van Marta Comellas (Afdeling Organische Scheikunde)

 

Preparatie van de monsters

Onbehandeld biologisch materiaal is meestal van zichzelf te dik om elektronen door te laten. Daarom wordt het meestal vooraf in uiterst dunne plakjes (coupes) van ongeveer 70 nm gesneden. Als de coupes dikker zouden zijn zouden alle elektronen tegenhouden worden en zou het beeld helemaal zwart zijn. Het snijden van zulke ultradunne coupes geschiedt met een ultramicrotoom en speciale glas- of diamantmessen. Het snijden is een techniek die veel precisie en ervaring vergt.
Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig verschillen in elektronen doorlaatbaarheid, waardoor zonder voorbehandeling een contrastarm beeld in een TEM zou ontstaan. Om dit probleem te voorkomen wordt het materiaal eerst blootgesteld aan 'elektronen-ondoorlatende' verbindingen van zware metalen, ihb osmium, die zich selectief alleen aan bepaalde specifieke structuren in het monster kunnen binden. In het TEM beeld verschijnen deze metaal "aangekleurde" structuren dan als donkere delen. Daarentegen komen andere structuren die minder affiniteit hebben voor deze 'kleurstoffen', en die dus minder elektronen terugkaatsen, als lichtere plekken in beeld.
De viewer hieronder toont plaatjes van de voorbereiding van de monsters voor TEM waarneming:
 

TEM preparatie
	Naar de uitleg over: Fixatie   Spoeling en 'kleuring'   Dehydratatie   Inbedding in hars   Harsblokje trimming en ultradun snijden   Opvangen van coupes op gridje
Gif animatie (1592 KB) of Quick Time movie filmpje (768 KB). Kari Meijer en Linda Spiegelberg aan de ultramicrotoom bij het snijden van ultradunne coupes.		klik op plaatje voor een zoom

 

1. Fixatie: Brokjes ruw materiaal, bijv. een stukje weefsel van enkele millimeters of losse cellen, worden gefixeerd met chemische stoffen (bijv. glutaaraldehyde) of kou (vloeibaar propaan van -190°C dat als een fysisch fixatief fungeert). Fixeren doet men om de fijne structuren in cellen zo intact mogelijk vast te leggen en de cellen doorlaatbaar te maken voor de componenten die nodig zijn in de vervolgstappen. Fysische fixatieven en chemische fixatieven en de meeste andere chemische stoffen die gedurende de preparatie van monsters voor TEM worden gebruikt zijn of gevaarlijk koud of erg giftig. Daarom is gebruik van beschermende maatregelen zoals een zuurkast, labjas, handschoenen en veiligheidsbril een vereiste.
2. Spoeling en 'kleuring': Na fixatie en uitspoelen van het fixatief wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen (bijv. osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat) die zich bijzonder binden aan bepaalde celregio's zoals vetgroeprijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern, en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Zulke metaalverbindingen hebben de eigenschap dat ze elektronen weerkaatsen waardoor de ermee gemerkte structuren in de elektronemicroscoop als donkere plekken verschijnen. Dit noemt men ook wel 'kleuren', hoewel in de elektronemicroscopie geen sprake is van ware kleuren. Zo zijn in het voorbeeld TEM-plaatje van een stuifmeelbuis van tabak de membranen van een mitochondrion [= Mi] en twee Golgi apparaten [G], alsmede een eiwitrijke microtubulus [Mt] en actine filamenten [AF] (beide cytoskelet elementen) zwart 'gekleurd'.
3. Dehydratatie: Om extreem dunne coupes (plakjes materiaal van 60 tot 90 nm 'dikte') te kunnen snijden die één geheel blijven en tegelijkertijd elektronen door kunnen laten, worden de gekleurde stukjes materiaal in kunsthars (plastics) ingebed. Omdat de meeste van deze harsen hydrofoob zijn, is het nodig om eerst alle water uit het monster te verdrijven via wasstappen van toenemende ethanol of aceton concentratie, gevolgd door wasstapen in een andere apolair en vluchtig middel zoals propyleen oxide.
4. Imbedding in hars: Dan wordt het materiaal geleidelijk geïnfiltreerd met de nog ongepolymeriseerde hars (bijv. methacrylaten, polyester en epoxy-haren, acrylen, polyethyleenglycol en andere) opgelost in een apolair en vluchtig overgangsmiddel dat verdampt. De concentratie hars neemt toe tot verzadiging en er ontstaat een stroperige massa. Er wordt telkens een stukje van hars-doordrongen materiaal in een houdertje geplaatst, bijv. een gelatine capsule zoals voor medicijnen; het resterende volume in de houder wordt met verse hars aangevuld. Dan volgt een polymerisatiebehandeling door middel van warmte van een oven of met een magnetron of door katalysatie met ultraviolet licht, waarmee hard en goed snijbare blokjes met materiaal worden verkregen.
5. Trimming van het blokje hars en ultradun snijden : coupes met een dikte van zo'n 70 nm kunnen alleen gemaakt worden met bijzondere messen van gekliefd puur glas (driehoekige glasmessen met een uiterst scherp randje, die verkregen zijn met een glasmessen maker) of met een diamant mes. Het snijden gebeurt met behulp van een ultra microtoom (dat is een precisie snij-instrument met talrijke instelmogelijkheden). Na elke snede schuift de microtoom monsterhouder één stap op, ong. 70 nm dus. De mechanische weerstand gedurende het snijden wordt beperkt door het snijvlak zo klein mogelijk te maken; daarom wordt het blokje hars met materiaal vooraf getrimd tot een piramidevormig stompje met een gladde en vlakke top. Die top heeft zelf de vorm van een gelijkbenig trapezium met een afmeting van pakweg één bij een halve millimeter (ziehier drie vergrotingen van een getrimd blokje hars met ingebedde stuifmeelkorrels: laag, medium, hoog).
6. Opvangen van coupes op gridje: Water in een heel klein vaatje achter het mes zorgt voor lubrificatie van het snijvlak enopvang van de coupes; de afgesneden plakjes komen niet in de lucht te hangen waar ze door elektrostatische lading weg zouden kunnen springen of makkelijk weggeblazen zouden kunnen worden, maar ze komen te drijven op het wateroppervlakte van dit vaatje. De exacte dikte van de coupes kan bijzonder nauwkeurig worden ingeschat aan de had van de interferentiekleur van de drijvende coupes. De uiterst fragiele rijtjes van trapezium-vormige coupes worden 'opgelepeld' van het wateroppervlakte op een zogenaamd gridje. Een gridje bestaat uit een metaalschijf (<5 mm) met roosterpatroon, die vooraf bedekt is met een elektronen-doorlatend vliesje van Formvar dat als steunbedje voor de coupes fungeert. Gridjes worden daarna met een staafvormige monsterhouder in de elektronenmicroscoop ingesluisd. (Opmerking: alleen het materiaal dat tussen de balken van het rooster komt te liggen kan zichtbaar gemaakt worden).